柴油是柴油机主要燃料，通常轻柴油用于高速柴油机；中、低速柴油机用轻柴油或重柴油。柴油机用喷油泵和喷油器将高压燃油以雾状喷入气缸，与空气混合燃烧。因此，柴油机可用挥发性较差的重质燃料或劣质燃料，如原油和渣油等。

在燃用原油和渣油时，须过滤杂质和水分，还需对供油系统进行预热保温，降低燃油粘度，以便输送和喷射。如果柴油机设计合适的燃烧室也可燃用乙醇、甲醇和汽油等轻质燃料。可加入添加剂提高十六烷值改善轻质燃料的着火性能，或与柴油混合使用。一些气体燃料，如天然气、液化石油气、沼气和发生炉煤气等也可作为柴油机的燃料，但这时通常以气体燃料为主，以少量柴油引燃，这种发动机称为双燃料内燃机。